1.體外胚胎、胚珠和子房培養
胚、胚珠和子房離體培養是克服蕓薹屬植物遠緣雜交障礙的常用方法。豬又(1978)首次成功地將子房培養應用於大白菜和甘藍種間雜種的胚挽救。宮(1995)通過子房培養成功獲得了大白菜與白芥的種間雜種。
2.原生質體融合
細胞融合避免了性交的過程,所以不存在受精不親和的問題。近年來,高等植物體細胞雜交取得了長足的進展。當不能進行有性雜交時,可以利用體細胞雜交獲得種間和屬間雜種。竹下等人(1980)通過甘藍和大白菜原生質體融合人工合成了甘藍型油菜。體細胞融合開辟了從親緣關系較遠或受精親和性極低的雜交組合中獲得新材料和新品種的新途徑。
3.多代連續回交
多代連續回交法對種間或屬間遠緣雜交克服雜種不育性有壹定作用。回交中,至於用哪個原始親本回交,要看哪個親本會保留待交後代中的優良遺傳性狀。如果壹次回交不夠,可以繼續進行第二次或第三次回交。根據大白菜的相關研究,值得說明的是回交結實強度與雜交世代及親本類型有關。
4.誘導二倍體
因為有些遠緣雜種沒有同源基因組或完整基因組,所以雜種完全不育。人工處理誘導二倍體可以成功克服不育性。如果用秋水仙堿處理雜交幼苗,它們可以產生二倍體並成功克服不育性。需要指出的是,並不是所有遠緣雜交F的不育性都可以通過染色體加倍來克服。只有當F的減數分裂因來自親本的染色體不具有同源性而不能配對,只有少數能配對時,加倍雜種染色體數才會提高雜種的育性。
大白菜已在種間和屬間廣泛雜交。Warwick,SI和A.Francis(1994)在《巴西利亞野生德國種質和近緣作物指南》中列舉了大量遠緣雜交的例子。
(2)細胞工程技術
自本世紀初以來,單倍體壹直是植物育種家追求的目標。遊離小孢子培養和花藥培養均可獲得單倍體,進而形成DH植株。但與花藥培養相比,遊離小孢子群體用於遊離小孢子培養,胚和再生植株均來自小孢子細胞,排除了花藥壁和絨氈層組織的幹擾。另壹方面,遊離小孢子培養技術可以在廣泛的基因型範圍內獲得胚狀體發生率高的小孢子胚和再生植株,並且小孢子植株具有自然加倍成二倍體的特性,因此遊離小孢子培養在遺傳和育種研究中具有非常誘人的應用前景。
20世紀70年代初,Nitsch等人(1973)在研究曼陀羅花藥培養時建立了遊離小孢子培養技術,Lichter(1982)在甘藍型油菜遊離小孢子培養過程中首次獲得,近20年來,該技術在大白菜育種中的應用日趨成熟。20世紀80年代末,Sato等人(1989)首先進行了大白菜遊離小孢子培養。90年代初,曹明清等人(1992)在國內率先開展了大白菜小孢子培養。目前國內已有幾個單位開展了這方面的研究工作,並成功應用於育種實踐。李根義等(1999;2000年,利用遊離小孢子培養技術育成了優良新品種白羽11和白羽7號。曹明清等(1993)利用遊離小孢子培養技術獲得了抗除草劑大白菜植株。目前,大白菜小孢子培養技術已成為創新種質資源的常規技術,並發揮著越來越重要的作用。
遊離小孢子培養技術也可用於篩選各種抗性突變體。Akmad等(1991)用紫外線輻射處理早熟油菜小孢子,獲得了少量對鏈格孢菌和除草劑“CleanR”抗性增強的後代。曹明清的研究組曾經在培養基中添加過鏈格孢菌毒素。由此,從誘導的小孢子胚中篩選出對白菜黑斑病具有壹定抗性的大白菜小孢子植株。
(3)基因工程技術
隨著組織培養和DNA重組技術的建立和不斷完善,現代生物技術已廣泛應用於多種作物的種質創新和新品種選育。然而,由於大白菜組織培養和再生體系的困難,轉基因技術在大白菜育種中的應用受到了壹定的限制。20世紀80年代以來,大白菜組織培養和高頻植株再生體系逐漸建立,在此基礎上的轉基因研究也取得了壹些突破。
楊廣東等(2002)以根癌農桿菌為外植體,將修飾的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(sck)導入大白菜自交系GP-11和雜交種4號,獲得了卡那黴素抗性植株。PCR檢測和Southern雜交證實sck基因已經整合到大白菜基因組中。豇豆胰蛋白酶抑制劑的活性檢測表明,大多數轉基因植株對牛胰蛋白酶有壹定的抑制活性,而對照非轉基因植株的抑制活性很低。離體葉片取食和田間自然抗性鑒定進壹步證明轉基因植株對菜青蟲有壹定的抗性。
朱昌祥等(2001)以福山大光頭的葉柄為試材,研究了影響大白菜植株再生和基因轉化頻率的因素。在此基礎上,建立了大白菜高效再生體系和高效基因轉化體系,並將蕪菁花葉病毒CP基因導入大白菜,獲得轉化植株。PCR檢測和Southern雜交分析證明TuMV-CP基因已經整合到大白菜基因組中。north blot分析和ELISA表明TuMV-CP在轉錄和翻譯水平上得到有效表達。對轉基因植株T代的遺傳分析表明,外源基因在轉基因植株後代中的分離遵循3: 1的規律。抗病性測定表明,轉基因植株具有明顯的抗病毒感染能力。
劉公社等(1998)從大白菜小孢子胚狀體中獲得了抗除草劑轉基因植株。從大白菜小孢子培養中獲得的子葉胚狀體用碎玻璃渣摩擦,然後用根癌農桿菌培養,在含有篩選劑Basta的培養基上再生出幾個綠苗。自花授粉後,對其後代的Basta抗性鑒定表明,在抗性植株的基因組中存在壹個bar基因插入點,並對轉化植株的小孢子進行了再培養。後代小孢子植株對Basta抗性的分離率表明轉基因是雜種。