本文簡要介紹了可從液體活檢樣本中檢測至少數百種蛋白質的高含量蛋白質組學技術(圖1)的原理，包括RPPA反向蛋白質微陣列技術(非生物因子提供)、質譜技術、抗原/抗體陣列技術、基於適配子的檢測技術和正交延伸技術(PEA)，並比較了上述技術的優缺點(表(原文鏈接:https://doi . org/10.165438+
蛋白質組學中液體活檢生物標誌物的研究背景
與腫瘤診斷的“金標準”組織活檢相比，液體活檢可以通過微創方法獲得測試樣本，克服異質性，實現動態監測。目前用於液體活檢的體液主要是血液和尿液，但理論上液體活檢適用於任何人體內循環或其他與人體相關的液體(圖2)。作為大多數細胞功能的直接執行者和大多數癌癥治療中的直接藥物靶點，多蛋白質組學數據的分析可能在癌癥進展的所有階段實時提供更有價值的臨床信息。液體活檢樣本中的蛋白質組具有很大的復雜性，如蛋白質豐度的連續快速變化和翻譯後修飾。同時，蛋白質組技術相對於高度復雜的測序技術仍存在壹定的局限性，導致對蛋白質組的探索仍落後於基因組技術，臨床轉化效率極低，目前僅通過40多個基於液體活檢的蛋白質組生物標誌物。因此，迫切需要壹種新的蛋白質技術來實現在癌癥液體活檢中尋找生物標誌物的目標。
各種技術的比較
壹.質譜分析
由於體液樣品中蛋白質的復雜性，現代質譜技術通過不斷優化樣品制備方法、發展蛋白質定量技術、改變質譜掃描模式來提高檢測精度。質譜可以在沒有假設驅動的情況下，無偏倚地掃描樣本中的蛋白質，因此可以作為癌癥體液樣本早期生物標誌物發現的首選方法。目前基於質譜的生物標誌物策略主要有:(1)在發現、驗證、驗證三個階段，樣本數量逐漸增加，檢測蛋白質範圍逐漸減小的“三角策略”；(2)在發現和驗證階段，使用鳥槍法在大樣本隊列中檢測盡可能多的蛋白質。平行分析表明，具有顯著差異的蛋白質可以用作準生物標誌物的“矩形策略”。目前，基於質譜的液體活檢已應用於卵巢癌、泌尿系統癌、結直腸癌等癌癥。但質譜技術要廣泛應用於臨床試驗，就必須簡化和規範檢測過程，提高檢測通量、準確性和魯棒性，突破翻譯後修飾蛋白的檢測局限。
第二，抗原/抗體陣列技術
抗體陣列是壹種通過熒光、化學發光或寡核苷酸標記將特異性抗體固定在修飾的平面基底上來檢測多個靶(通常數百個)樣品的方法。適用於血清學分析，如腫瘤相關低豐度分泌蛋白的檢測。然而，由於檢測通量、檢測動態範圍、批量效應、信號飽和度和定量準確性的限制，抗體陣列只能作為基於體液的蛋白質組分析的方法之壹。抗原陣列又稱功能蛋白陣列，可作為抗原檢測平臺，檢測抗體組成的細微變化。其早期熱門應用是通過血清自身抗體研究生物標誌物(AAB)。最全面的人類抗原陣列覆蓋超過81%的蛋白質，是血液蛋白質全景分析的強大工具。然而，抗原陣列的靶標擴展性、可重復性、批量效應和高成本仍然限制了其應用。
第三，基於適體的檢測
SOMAscan是高通新開發的定量蛋白質組檢測工具，它基於緩慢修飾的蛋白質體，可以與不同的蛋白質緊密結合。SOMAmer是壹種寡核苷酸配體，它與光解接頭或熒光標記結合。在構象識別和生物素介導的純化後，通過紫外線照射洗脫體蛋白，並對其在反應樣品中的蛋白豐度進行表征和定量。該方法具有超高的特異性和親和力，批間差異小。目前可並行分析7000+蛋白質種類，在篩選結直腸癌和非小細胞肺癌臨床相關生物標誌物中發揮關鍵作用。然而，與抗體檢測相比，現階段可供研究的核酸適配體種類有限，尤其是以翻譯後修飾蛋白為導向的核酸適配體的開發仍處於起步階段。同時，由於核酸適體對抗原決定簇的高親和力，大量的信號會幹擾蛋白質標誌物的研究，影響檢測的準確性。
四、相鄰延伸技術(PEA)
PEA將基於抗體的免疫測定(ELISA)與PCR或第二代測序(NGS)技術相結合。與質譜法相比，PEA可以用更低的樣品量檢測更寬的動態範圍，具有高靈敏度、高準確度、可重復性和高保真度。目前最先進的PEA探測由Olink公司商業化，可對3072個目標進行標準測量。PEA首先用於鑒定結腸直腸癌的血液預後標記，隨後用於卵巢癌、前列腺癌和其他癌癥種類的早期檢測、伴隨診斷和疾病監測。PEA檢測與讀數方法有關(qPCR，NGS)，分析大隊列樣本時仍需考慮實驗誤差和批次效應。其次，翻譯後修飾蛋白的研究對抗體的發展有很大的瓶頸，其捕獲受到壹定程度的限制。
動詞 （verb的縮寫）反向蛋白質微陣列技術(RPPA)
RPPA起源於20年前。它將完全變性的蛋白質溶解產物固定在特殊的載玻片上。通常，每個溶胞產物將被濃度梯度稀釋。然後，點樣的載玻片將與高度特異性的抗體壹起孵育，定量信息將通過信號放大化學顯色或熒光檢測來捕獲(圖3)。RPPA可廣泛用於數百至1000多個大樣品的超穩定平行分析，定量準確。可以系統深入地檢測500+種細胞表面受體蛋白、細胞信號關鍵蛋白和蛋白修飾(磷酸化、乙酰化、甲基化等。)、蛋白酶、轉錄因子等代表性靶標，包括直接和間接的上下遊蛋白質網絡分析。基於以上特點，RPPA被廣泛應用於癌癥基因組作圖項目(TCGA)，其公開數據集可在線獲取(TCPA，http://tcpaportal.org)。由於其最小的批次差異，RPPA可以作為蛋白質中生物標誌物驗證的有力工具，並已成功應用於肺癌新生物標誌物的驗證。此外，外泌體蛋白的檢測已經成為RPPA在癌癥液體活檢中的另壹個熱點應用。非生物在國內構建了基於MD Anderson金標準的RPPA分析技術平臺，提前完成了壹系列的工作流程開發、驗證和優化，不斷擴充抗體庫，建立了完整的原始信息分析體系。幫助國內科研、臨床工作者和藥物研發相關用戶快速高效開展疾病尤其是腫瘤相關信號通路全景分析、分子機制挖掘、腫瘤相關藥理研究和靶向藥物研發。RPPA復雜的技術流程和嚴格的抗體篩選流程將不再是國內科研人員開展基礎和轉化醫學研究的絆腳石。(詳情點擊下方“閱讀原文”)
前景
未來，在蛋白質組學技術不斷發展的前提下，各技術的聯合互補應用可以作為基於腫瘤體液活檢的生物標誌物的可行正交驗證策略(如圖4)。非生物有機體依托RPPA技術等各種基因組學新技術，以腫瘤精準治療研究和轉化為核心使命。我們期待出現壹個更精簡但連貫和標準的蛋白質生物標誌物開發過程，最終將應用於癌癥轉化醫學研究。